Home Биология Биологично действие на лазерната терапия

***ДОСТЪП ДО САЙТА***

ДО МОМЕНТА НИ ПОСЕТИХА НАД 2 500 000 ПОТРЕБИТЕЛИ

БЕЗПЛАТНИТЕ УЧЕБНИ МАТЕРИАЛИ ПРИ НАС СА НАД 7 700


Ако сме Ви били полезни, моля да изпратите SMS с текст STG на номер 1092. Цената на SMS е 2,40 лв. с ДДС.

Вашият СМС ще допринесе за обогатяване съдържанието на сайта.

SMS Login

За да използвате ПЪЛНОТО съдържание на сайта изпратете SMS с текст STG на номер 1092 (обща стойност 2.40лв.)


SMS e валиден 1 час
Биологично действие на лазерната терапия ПДФ Печат Е-мейл

БИОЛОГИЧНО ДЕЙСТВИЕ НА ЛАЗЕРНАТА ТЕРАПИЯ

Лазерите все по-широко се прилагат в медицината. Мощните високоенергетични лазери се използват като хирургичен интрумент (светлинен скалпел). В съчетание с фотосенсибилизатори като хематопорфирин или фталоцианин нискочестотните лазери се прилагат за избирателно разрушване на клетките на ракови тумори (фотодинамична лазерна терапия). И накрая, широко е разпространеното облъчването на зарастващи рани или кръв на човека (лазеротерапия) с нискочестотни лазери.

1.Примери на лазерна терапия

Постоянно в научната литература се публикуват десетки статии по терапевтичното приложение на лазерите. Облъчването на кръвта и ставите при ревматоиден артрит, лечение на безплодие в мъжа, очни болести, включително глаукома, дисфункция на пикочния мехур, исхемична болест на сърцето, кожни болести и болести на кръвта, усложнения при хирургични травми, пиелонефрит, плацентарна недостатъчност, туберкулоза на белелите дробове, подготовка на болните за хирургични операции – това е един не пълен списък за приложение на лазерната терапия.

Едновременно с натрупването на опит започван и разочарованията. Обобщаването на голям материал, включващ и прилагането на плацебо (когато болният е “преминал” целият курс на лечение, но не са включвали лазер) и двойно сляп контрол (когато за това, къде има плацебо, а къде лазер, не знаят нито болният нито лекуващият) показва в някои случаи отсъствие на статистички достоверни подобрения в състоянието на болния. В случаи на лечебен ефект лекарите се оплакват от лоша възпроизводимост на резултатите, различия в чувствителноста към облъчване на отделните болни, опасност от предозиране, когато лечебният ефект се сменя с неблагоприятно въздействие.

Основните причини, които затрудняват по-широкото използване на лазерната терапия са очевидни: 1) отсъствие на научно обяснение на наблюдаваните положитерни (и отрицателни) ефекти на лазерното облъчване; 2) отсъствие на обективни методи за контрол за резултатите от облъчването, които позволяват да се даде оптимална доза на облъчване във всеки конкретен случай. Втората причина е свързана с първата: като не разбирайки какво се извършва, не трябва да се лекува правилно.

2. Биологично действие на нискоинтензивния лазер

Какво е известно за действието на лазерното облъчване върху най-прости обекти, отколкото болният организъм на човека? По този въпрос съществуват многобройни резултати от изследвания, но нека разгледаме някои добре установени факти:

1. Излъчване с дължина на вълната 400-500 и около 600 нм води до увеличаване на скороста на делене на някои микроорганизми, а така също до увеличаване на синтезата на белтъци. При това се наблюдава изразена екстремална зависимост на стимулиращото действие на лазерното облъчване от дозата; интервалът на интензивностите, в границите, на които се наблюдава положителен ефект е 1.5-2 пъти.

2. При облъчване на изолирани митохондрии от черен дроб от светлина на хелий-неонов лазер (ХНЛ) в тях се увеличава съдържанието на АТФ, електричният потенциал на вътрешната митохондриална мембрана и рН в матрикса нарастват, а така също се наблюдават и известни изменения във формата на матрикса.

3. Облъчването на фибробласти на човека със светлина на ХНЛ съществено увеличава скороста на нарастване на популацията на клетки в експоненциалната фаза и (в случай на ембрионални фибробласти) адхезията на клетките на подложката.

4. Лазерното облъчване на клетки, отделени от епителия на ретината, води до увеличаване на митотичния индекс.

5. Облъчването с ХНЛ обикновено не предизвиква бласттрансформация на изолирани лимфоцити, но значително увуличава бласттрансформацията, предизвиката от фитохемаглутенин (ФХГ), а така също води до увеличаване на митотичния индекс на з-я и 4-я дни след облъчването с ниски дози на ХНЛ.

6. Под действие на облъчването с ХНЛ се увеличава съдържанието на вътрешноклетъчния калций (Са2+) в левкоцитите, оцветяване на нуклеиновите киселини в клетките с флуоресциращ оцветител (маркер) акрединово оранжево и изменение на морфологичната структура на хроматина. По всичките си параметри на действие лазерното излъчване в оптимална доза е близко с действието на ФХГ.

7. При облъчване на кръв непосредствено в кръвоносните съдове се наблюдава разширяване на съда по-горе и по-долу от мястото на облъчване. Този ефект изчезва при заменянето на кръвта с перфузиран физиологичен разтвор. Този ефект на вазодилатация води до подобряване на кръвоснабдяването на органите.

По такъв начин, наблюдаваните в клиниката ефекти (противовъзпалително действие на лазерното облъчване, ускоряване на регенерацията на увредените тъкани и подобряване на кръвоснабдяването на органите) може да бъдат свързани с три ефекта на лазерите, получени при експерименти:

1)       повишаване на активноста на фагоцитите;

2)       усилване на пролиферацията на клетките;

3)       подобряване на циркулацията на кръвта по кръвоносното русло в резуртат от разхлабването на стените на кръвоносните съдове (вазоцилатация).

3. Първични фотохимични реакции

Клиничните наблюдения както и експерименталните данни, получени на клетки и лабораторни животни, сами по себе си не позволяват да се отговори на въпроса за първичните молекулярни механизми на действие на лазерното облъчване върху биологичните структури, но дават възможност да се формулира работна хипотеза за възможните първични механизми. Такава хипотеза трябва да съдържа отговор за “молекулите-мишени” на лазерното лъчение, за механизма на първичните фотохимични реакции, предизвикани от лазерното облъчване и последвалите събития, водещи до крайния фотобиологичен ефект. Предполага се, че лазерното облъчване може да предизвиква три различни фотохимични реакции:

1) фотоокисление на липидите на клетъчните мембрани; 2) фотореактивиране на ензима супероксиддисмутаза (СОД); 3) фотолиза на комплексите на азотния окис (NO).

Ето какво показват експерименталните резултати.

4. Фотоокисление на липидите в мембраните

Чистите фосфолипиди, които са структурната основа на всички клетъчни и вътрешноклетъчни мембрани, не поглъщат светлина във видимата и инфрачервената области на спектъра, които са характерни за излъчването на обикновените лазери. Но ако към фосфолипидите се добави немного фотосенсибилизатор, например хематопорфирин или фталоцианин, то под действие на лазерната светлина (ХНЛ) се извършва окисление на липидите (фотодинамичен ефект), съпровождано от образуване на прекиси (фотопероксидация). Фотопероксидацията на липидите се наблюдава и при лазерно облъчване на суспензии от клетки или митихондрии винаги, ако се добави сенсибилизатор, а понякога и без него. По всяка вероятност при някои заболявания в мембраните се натрупват природни сенсибилизатори като е възможно това да бъде хематопорфирин или неговите производни.

5. Действие на липидната пероксидация на мембраните и клетките

Действието на липидната перксидация на фосфолипидния слой на мембраните е добре изучено и е свързано с няколко основни ефекта:

1)       избирателно се увеличава проницаемоста за йоните на Н+ и/или ОН-;

2)       увеличава се проницаемоста за йоните на Са2+;

3)       намалява се електричната стабилност и може да настъпи “самопробив” на мембраната от собствения електричен потенциал.

В клетъчните мембрани към това се присъединява и окислението на SH-групите и увреждането на калциевата помпа (Са2+-АТФаза), която се превръща в канал за Са2+-йони.

Един от главните резултати на всичките тези ефекти е повишаването на концентрацията на Са2+ вътре в клетката. В клетъчното обкръжения концентрацията на йоните на Са2+ е сравнително висока – около 1 мМ (10-3М), докато вътре в клетките в норма се поддържа ниска концентрация – около 10-7М, което основно се осъществява от функционирането на ензима-помпа Са2+-АТФаза, а отчасти и възможно от митохондриите (рис.1, а и б). При липидна пероксидация Са2+-помпа се уврежда, но нейната “тръба” – каналйт за йоните остава (рис.1, в) и Са2+-АТФаза вместо да изпомпва Са2+-йони от клетката, започва да го пропуща вътре в нея ( в посока към по-ниската концентрация). В този случаи и митохондриите лошо подпомагат тези процеси на йонен транспорт, защото под действие на прекисното окисление техните мембрани стават проницаеми за йоните и те не подържат мембранен потенциал.

Рис.1. Калциеви помпи в клетката: а – калциева помпа в клетъчната мембрана и мембраните на вътрешноклетъчните депа на калций (Са-АТФаза); б – електрофоретично натрупване на калций от митохондриите; в – изменение на свойствата на Са-АТФаза под действие на прекисното окисление на липидите: помпата престава да изпомпва Са2+-йони, които започват да проникват вътре в клетката през канала, образуван от увредената Са-АТФаза

Увеличаването на Са2+-йони при лазерно облъчване на изолирани клетки се наблюдава в суспензия на лимфоцити, което води до активация на клетките и тяхната пролиферация. Може да се предположи, че последователността на събитията при действие на лазерното облъчване е:

1) поглъщане на фотона от ендогенен фотосенсибилизатор и последваща липидна пероксидация (фотопероксидация);

2) влизане на йони на Са2+ в клетката;

3) активация на вътрешноклетъчните процеси.

6. Предстимулиране (priming) на фагоцити

Биологичните последствия от увеличената концентрация на Са2+ в клетъчната цитоплазма ще бъдат различни за различни в зависимост от типа клетки, подложени на лазерно облъчване. При облъчване на кръв, една от най-разпространените форми на лазерна терапия, има съществено действието на облъчването на левкоцитите (неутрофили и моноцити), които защитават организма от микробите и участват в регулацията на кръвообръщението. Показано е също, че продуктите на прекисно окисление на липопротеините на кръвната плазма предизвикват предстимулиране на клетките фагоцити (priming), т.е. 2-3 кратно увеличаване на отделяните от тях активни форми на кислорода (АФК) в отговор на сействието на стимула (който може да бъдат обвивки от бактериални клетки – лектини, например фитихемаглутенин, калций-пренасящи антибиотици и някои други вещества). Същността на явлението предстимулиране (priming) е показана на рис.2. Изходно клетката-фагоцит има върху повърхноста си някакво количество рецептори за стимулиране и при действие на стимула клетката се активира, което се съпровожда от отделяне на АФК и хемилуминесценция (ХЛ) в присъствие на луминол. Ако клетката се инкубира предварително с някакво съединение, което предварително увеличава количеството на Са2+-йони в цитоплазмата, се извършва увеличаване на рецепторите върху повърхноста на клетката. Именно това се наблюдава при инкубиране на неутрофили с продукти на липидна пероксидация. Сега вече добавянето на стимул води до мощен ХЛ-отговор, в сравнение с изходните левкоцити. Изследвано е също действието на облъчване с ХНЛ при предстимулиране на левкоцити, изолирани от кръв на здрави и болни от бронхит (рис.3). Съществува разлика при действие на лазерното облъчване в различни групи от болни. Към първата група може да се причислят левкоцитите, на които лазерното облъчване не действа (рис.3, а). Възможно е клетките на тези болни да не съдържат ендогенен сенсибилизатор, защото облъчването с ХНЛ в присъствие на сенсибилизатор, добавен отвън, води до забележим ефект на предстимулиране при ниски дози на облъчване и към подтискане на активноста на клетките при по-високи дози. Във втората група болни неголямото предстимулиране се извършва също и при отсъствие на екзогенен сенсибилизатор, въпреки че при добавяне на сенсибилизатора ефектът е много по-силен и се наблюдава при по-малки дози. В третата група ефектът на предстимулация е достатъчно силен при отсъствие на екзогенни сенсибилизатори, а при добавянето на сенсибилизатор само се намалява. Общото впечатление е такова, че левкоцитите в кръвта на различни болни пациенти се различават само по изходното съдържание на сенсибилизатора, а в останалото действието на ХНЛ е еднакво: при малки дози се наблюдава priming, а при високи дози – подтискане на реактивноста на клетките (т.е. ХЛ-отговор при въвеждане на стимула).

Рис.2. Усилване на луминол-зависимата хемилуминесценция на фагоцити в резултат на предстимулация (в частност, при лазерно облъчване)

Възможни са две главни биологични последствия от предстимулирането на левкоцитите (гранулоцити и моноцити) при лазерното облъчване на кръв. Първо, по-мощното отделяне на АФК (супероксидни радикали, водородни прекиси, хидроксилни радикали, хипохлорит) и NO водят до по-ефективна фагоцитоза, т.е. до разрушаване на бактериите и гъбичките от тези клетки. Второ, по-голямото отделяне на NO трябва да се съпровожда с разширяване на кръвоносните съдове и подобряване на кръвообръщението.

Рис.3. Прайминг на левкоцити, изолирани от кръвта на болни с различни белодробни заболявания, предизвикан в резултат на лазерно облъчване: а – хроничен бронхит; б – хронично възпаление на белити дробове; в- тежка полисегментна пневмония в остра фаза. 1 – в присъствие на сенсибилизатор, 2 – без сенсибилизатор

7. Антирадикално действие на лазерното облъчване

Механизмът на биологичното действие на лазерното нико енергетично облъчване е на основата на усилване на продукцията на свободни радикали: в първия етап – генерация на липидни радикали (при фотопероксидация), а във втория – на супероксидни радикали и азотен окис. Трябва да се отбележи, че в някои случаи облъчването с лазер води до забележимо намаляване на нивото на свободните радикали в системата. Както вече споменахме по-горе, положителното действие на лазерното облъчване се наблюдава при използването му за лечение на дълго незаживяващи рани и трофични язви. Показано е заживяване на раните в деца при облъчването им с ХНЛ.

Рис.4. Схема за измерване на хемилуминесценцията (ХЛ) на ексудат на рана (а) и зависимост на интензивноста на ХЛ от дозата на облъчване на образеца с ХНЛ (б). По ординатната ос – амплитудата на ХЛ в % към тази на необлъчения ексудат

Възможно е това да е свързано с усилването на антирадикалната защита в областа на раната. Това се потвърждава от опитите с изменение на интензивноста на хемилуминесценция на ексудати от рани в присъствие на добавяне към тях на водородни прекиси. Схемата на измерване на такава хемилуминесценция е дадена на рис.4, а. След лазерното облъчване (1) към раната (2) се допира кръгче от филтърна хартия с диаметър около 1 см, след което това кръгче се пренася в чашка с фосфатен буферен разтвор (3) и се отмева кръгчето от ексудата с размесване на разтвора. След това разтвора се пренася в кюветата на хемилуминометъра, в нея се поставят водородни прекиси (Н2О2) и се регистрира хемилуминесцентния отговор (4). Хемилуминесцентното светене е свързано с образуването на АФК (супероксидни радикали и хидроксилни радикали от разлагането на Н2О2 от ексудата. Добавянето към ексудата на ензима супероксиддисмутаза (СОД), отстраняващ супероксидните радикали, така както и добавянето на ензима каталаза, отстраняващ Н2О2, подтиска интензивноста на ХЛ. Облъчването на ексудата със светлина на ХНЛ така също подтиска светенето (рис.4, б). По такъв начин лазерната светлина действа така както супероксиддисмутазата и каталазата. Тъй като за няколко секунди облъчване едва ли е могло да се извърши образуване на нова супероксиддисмутаза и каталаза, то е естествено да се предположи, че изходно, поради някакви условия активноста на двата ензима е понижена, а лазерното облъчване е реактивирало един от ензимите. Нека припомним, че двата ензима имат поглъщане при дължина на вълната на ХНЛ от 633 нм.

8. Фотореактивация на Сu-Zn-супероксиддисмутаза

В научната литература съществуват противоречиви данни по този въпрос. В същото време при опити с изолирана Сu-Zn-супероксиддисмутаза е било показано, че понижаването на рН на разтвора и Н2О2 инактивират ензима (рис.5, а), докато при следващото облъчване инактивиране на ензима при рН 5.9 със светлина от ХНЛ се наблюдава пълната реактивация на СОД (рис.5, б).

Рис.5. Фотореактивация на Сu-Zn-супероксиддисмутаза (СОД) под действие на светлината на ХНЛ: а –инактивиране на СОД при рН 5.9; б – фотореактивация на СОД под действие на облъчване с ХНЛ

Направен е и опит да се обясни механизма на инактивиране и фотореактивация на СОД в кисела среда. За тази цел се изучават спектрите на поглъщане и ЕПР-сигнали на ензима при неговата кисеринна инактивация след лазерно облъчване. Получените данни свидетелстват за това, че в основата на инактивацията на Сu-Zn-супероксиддисмутаза е протонирането на хистидиновия остатък, влизащ в състава на активния център на ензима, а лазерното облъчване води до депротониране на хистидина и образуването на връзка Zn-N< с възстановяване на структурата на активния център на ензима и неговата ензимна активност (схема 1). Едновременно се възстановяват и други свойства на активния ензим: спектърът на поглъщане и ЕПР-спектър.

Схема 1. Механизми на инактивация и фотореактивация на СОД в кисела среда

8. Възможни биологични последствия от инактивацията на СОД и нейната реактивация

Както е известно супероксиддисмутазата намалява концентрацията на супероксидни радикали , катализирайки реакцията на дисмутация:

В резултат се намалява стационарната концентрация на супероксидни радикали в клетките и тъканите, където този радикал се образува, особено при патологии.

Супероксидните радикали се образуват при редукция на молекулярния кислород от ензима НАДФН-оксидаза. Основен продуцент на този радикал са клетките-фагацити в кръвта като неутрофилите и моноцитите. Водородните прекиси, които се образуват в резултат на дисмутацията на супероксидните радикали (реакция 2 на схема 2) се използват за синтезата на антимикробното вещество – хипохлорит (реакция 3), а нейното повишено количество се разлага от ензимите каталаза и пероксидази (реакция 4). При недостатъчно количество на СОД супероксидните анион радикали могат да имат неблагоприятни ефекти, основно като резултат от две реакции: образуване на йони на двувалентното желязо (Fe2+) от тривалентното (Fe3+) (реакция 7, схема 2) и свързването с азотния окис (реакция 5).

Схема 2. Механизми и биологични последствия на инактивирането и реактивирането на СОД

Фотореактивацията на СОД може по такъв начин да опише три действия на лазерното лъчение върху организма: 1) антирадикално (поради предотвратяване на реакции 6-10; 2) разхлабване на стените на кръвоносните съдове (усилване на реакция 1 поради предотвращаване на реакция 5); 3) антибактериално действие (от ускоряването на реакции 2 и 3).

9. Фотолиза на азотно окисните комплекси

Двата разгледани по-горе механизми на действието на лазерното облъчване могат да бъдат обяснени основните феномени, отнасящи се до действието на лазерното лъчение от ХНЛ върху организма на човека и изолирани клетки. В последно време се появиха нови факти, потвърждаващи възможноста за съществуване на трети механизъм на действието на лазерното облъчване – фотолизата на азотно окисните комплекси.

Азотният окис (NO) е природен свободен радикал (.NO), изпълняващ в организма няколко функции, две, от които са особено важни за разкриване на действието на лазерното облъчване на кръвта. Първо, NO е предшественик на отделяния от клетките на ендотелия на стените на кръвоносните съдове фактор на разхлабване (EDRF – Endothelium derived relaxing factor), който играе водеща роля при регулацията на кръвното налягане. Второ, NO се отделя от макрофагите на кръвта и тъканите и изпълнява ролята на защитно средство против микроорганизмите и основно срещу гъбичната инфекция. Освен тези два ефекта (вазодилатация и микотоксично действие) NO изпълнява и други функции.

Рис.6. Изследване с ЕПР-метода на спиновите акцептори разцепването на комплекса на хемоглобина с азотния окис (а) и освобождаването на свободни азотни окиси (б)

Азотният окис е съединение със значителна реакционна способност, което лесно образува комплекси с околните молекули, например, със серумния албумин и хемоглобина. В присъствие на кислорода както самият NO, така и неговите комплекси постепенно се окисляват, образувайки нитрати и други съединения. Много производни на азотния окис, включително и лекарствени препарати, предизвикващи разширение на кръвоносните съдове, под действието на светлината се разпадат, образувайки NO. Съществуват експериментални данни за това, че светочувствителните комплекси на NO съществуват и в тъканите и се разпадат при осветяване. С метода на ЕПР е показано фотохимичното разпадане на комплекса NO-хемоглобин, при което по всяка вероятност се извършва освобождаване на азотен окис. Под действие на лазерното облъчване с дължина на вълната 436 нм (но не 633 нм!) се извършва бързо намаляване на ЕПР-сигнала на комплекса NO-хемоглобин както в разтвори от изолиран белтък, така и в еритроцити. При това с помоща на спинов акцептор е регистрирано отделянето на свободни NO (рис.6, б).

Природата на терапевтичното действие на ХНЛ (излъчване при 633 нм), СОД и хематопорфирина, двата възможни рецептори на фотони, действително притежават неголяма поглъщане при дадената дължина на вълната. Но как може да обясним терапевтичното действие на ИЧ-лазер, излъчването, на който лежи при 904 нм, където няма ивици на поглъщане, свързани с електронните преходи в биологично важните молекули? това са въпроси на бъдещите изследвания.

КОНТРОЛНИ ВЪПРОСИ

1.Какво представлява плацебо и двойно сляп контрол при изследване на клиничното действие при лазерна терапия?

2. Кои причини затрудняват прилагането на лазерната терапия?

3. Каква е биологичната роля на нискочестотното лазерно облъчване?

4. Посочете ефектите на нискочестотното лазерно лъчение в клиниката!

5. Какви три типа фотохимични реакции може да предизвика лазерното облъчване?

6. Посочете механизма, по който се извършва фотоокислението на липидите в мембраните при лазерно облъчване!

7. Кои са ефектите на липидната пероксидация във фосфолипидния слой при лазерно облъчване?

8. Какво представлява предстимулирането (priming) на фагоцитите при действие лазерна радиация?

9. Обяснете антирадикалното действие на лазерното облъчване!

10. Обяснете механизма на инактивиране и фотореактивация на СОД (супероксиддисмутазата) при лазерно облъчване!

11. Какви са биологичните последствия от инактивирането на СОД и нейната реактивация?

12. Каква е биологичната роля на фотолизата на азотно-окисните комплекси при действие на лазерното облъчване?

 

WWW.POCHIVKA.ORG