Киселинна хидролиза на белтъци. Определяне на аминен азот по метода на Сьорензен Печат

I. ТЕМА: Киселинна хидролиза на белтъци. Определяне на аминен азот по метода на Сьорензен

II. ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТ

Белтъчните вещества са биополимери, построени от голям брой a-аминокиселинни остатъци. В състава им участват около 20 a-аминокиселини, чието съчетание и подреждане обуславя богато разнообразие на природните белтъци.

Белтъчните вещества се разделят на протеини и протеиди. Първите се състоят само от a-аминокеселини, свързани чрез пептидна връзка, а вторите съдържат и други небелтъчни вещества, като въглехидрати, липиди, нуклеинови киселини и други.

При хидролиза на белтъчните вещества става разкъсване на пептидните връзки с присъединяване на вода. В началото на процеса се образуват високомолекулни продукти – пептони, които допълнително се разграждат до полипептиди, пептиди и аминокиселини.

NH2CHCONHCHCONHCHCOOH + H2O ®

К1 К2 К3

NH2CHCOOH + NH2CHCOOH+NH2CHCOOH

К1 К2 К3

Пълно разграждане на белтъчните вещества до аминокиселини се постига при хидролизата им с 6nHCl при 105°С в продължение на 24 часа при което почти напълно се разгражда триптофанът.

Чрез вариране на условията за хидролиза – температура, време, конц. на киселината – се променя и степента на разграждане на белтъците. Тя се контролира по нарастване количеството на свободните аминогрупи, чрез определяне на аминния азот, по  метода на Сьорензен.

III. НЕОБХОДИМИ ПРИБОРИ И РЕАКТИВИ:

1. Разтвор на яйчен белтък – белтъците на 2 яйца се разтварят в 1 л. дестилирана вода и се филтруват. Може да се използва и разтвор на казеин – 2 % разтвор във буфер с рН8.

2. Конц.НСl

3. Облодънна колба от 250 мл.

4. Обратен хладник

5. Пипети от 10 мл.

6. Ерленмайерови колби 100 мл. – 2 бр.

IV. НАЧИН НА РАБОТА

1. В облодънна колба от 250 мл. се поставят 100 мл. от белтъчния разтвор и 25 мл.конц. НСl. След разбъркване на сместа до хомогенизиране се вземат две проби по 10 мл. в ерленмайерови колби от 100 мл. за определяне на аминния азот. Колбата се свързва с обратен хладник и внимателно се загрява при слабо кипене в продължение на 2 часа. Степента на хидролиза на белтъка се контролира като през 40 мин. се вземат проби от 10 мл. хидролизат и се определя качеството на аминния азот в него по метода на Сьорензен.

Продължителност на хидролизата /мин/

0

40

80

120

Аминен азот в 10 мл. хидролизат /мг/

 

 

 

 

2. Принцип на метода на Сьорензен

- Определянето на аминните и карбоксилни групи в аминокиселините е свързано с големи трудности, поради амфотерния характер на тези съединения. Във воден разтвор те образуват вътрешно молекулни соли, поради което едно директно титруване на разтвора е невъзможно. Формалдехидът има способността да се свързва с аминогрупите, при което аминокиселините и белтъците губят основните си свойства и карбоксилните им групи могат свободно да бъдат титрувани с основа и от там по косвен начин да се определя и количеството на аминогрупите, респ.на аминния азот.

- Прибори и реактиви:

1. Формалин, неутрален по фенолфталеин

2. 10 % разтвор на NaOН

3. 0,1 n разтвор на NaOН

4. 0,1 % воден разтвор на неутрално червено

5. 1 % разтвор на фенолфталеин в 60° етанол

6. Бюрета от 10 или 25 мл. – 2 бр.

7. Цилиндър 10 мл.

 Ход на определянето:

2.1. Титруване на водни разтвори на аминокиселини

20 мл. от изследвания разтвор се неутрализира с 0,1 nNaOН при индикатор неутрално червено до оранжево оцветяване. Прибавят се 10 мл.неутрален формалин, при което разтворът придобива интензивно малинов цвят, поради киселия характер на образувалите се метиленаминокиселини. Неутрализирането на пробата с 0,1 nNaOН продължава при индикатор фенолфталеин, като цветът й от розов преминава в оранжев, жълт и накрая става отново розов. Отчита се количеството на изразходвания разтвор NaOН след прибавяне на формалина. Аналогично се разработва и контролна проба с 20 мл.дестилирана вода.

2.2. Титруване на кисели хидролизати

Към 10 мл хидролизат се прибавят 1-2 капки неутрално червено и се неутрализира с 10 % разтвор на NaOН до жълто оцветяване. Прибавят се 1-2 капки конц.НСl, докато разтворът придобие отново розов цвят, след което се титрува с 0,1 nNaOН до оранжево оцветяване. След прибавяне на 10 мл. формалин и няколко капки фенолфталеин, пробата се титрува с 0,1 nNaOН,  като се отчита нейното количество. Контролната проба се изпълнява с 10 мл.вода както в т.2.1.

V. ИЗЧИСЛЕНИЯ:

Аминният азот се определя по формулата

N=(a-b).F.1,4mг, където:

а – мл. 0,1 n разтвор на NaOН, изразходвани за титруване

b – мл 0,1 n разтвор на NaOН, изразходвани за титруване на контролната проба

F – фактор на разтвора на NaOН

1,4 – mг аминен азот, които съответстват на 1 мл 0,1 n разтвор на NaOН