Joomla Software solutions Template

Payday loan

ГЕННО ИНЖЕНЕРСТВО (РЕКОМБИНАНТНИ ДНК-МЕТОДИ). НАМЕСА ВЪВ ФУНКЦИЯТА НА ДНК

След като разгледахме по-важните рекомбинантни ДНК-методи за изследване на структурата на ДНК, сега ще се занимаем с методите за изследване и манипулиране на функцията на ДНК, т.е. на генната експресия.

Строго погледнато, и методите от предишния раздел имат връзка с генната експресия. Можем да я изследваме чрез РНК-блот или да направим изводи за даден белтък от последователността на гена му. Често обаче ни трябват не изводи за даден белтък, а самият белтък. С други думи, искаме да приведем клонираните гени в действие.

1. Клониране и експресия на гени в прокариоти

1.1. Пречки пред работата на еукариотен ген в прокариотен гостоприемник

Ще започнем с най-честата практическа задача, свързана с функцията на ДНК: да експресираме избран от нас еукариотен ген в прокариотна клетка. По-просто казано, искаме E. coli да произвежда желан от нас белтък, например инсулин. Ще можем ли да използваме вече разгледаните методи за геномно клониране?

Първото, за което се сещаме, е, че повечето еукариотни гени са накъсани. Те няма да работят в E. coli, защото бактерията не може да им изреже интроните. Освен това еукариотната мРНК не би се приела от прокариотни рибозоми, защото няма Шайн-Далгарнова последователност. В действителност обаче няма да се стигне до такива проблеми, защото транскрипцията изобщо няма да започне: E. coli не може да работи с еукариотни промотори. Остава да си спомним за фините механизми, които регулират генната експресия, и да махнем с ръка. В рамките на един човешки организъм инсулиновият ген се презаписва в панкреаса, но не и в мозъка, а ние искаме да го експресираме в чревна бактерия! Ясно е, че в геномната библиотека гените ще бъдат безжизнени като затворени книги.

Да се експресира какъв да е ген в каква да е клетка е възможно, но за това трябва да се погрижим ние. Трябва да изчистим гена от собствения му промотор и регулаторни последователности, защото те най-вероятно само ще пречат на новото място. Трябва да закачим отпред друг, подходящ промотор. Ако пробутваме еукариотен ген на бактерия, трябва да му изрежем интроните. Трябва да се погрижим мРНК на гена да е съвместима с рибозомите на клетката-гостоприемник. Затова не можем да работим както при изследването на структурата на ДНК. Дори ако вече имаме геномен клон на интересуващия ни ген, той не би ни свършил работа освен като сонда.

1.2. Синтеза на кДНК от мРНК с обратна транскриптаза

За да клонираме ген така, че да работи, трябва да изолираме не самия него, а презаписана от него зряла мРНК. Тя по-добре подхожда на целите ни от изходния ген, защото в нея интроните и повечето регулаторни последователности липсват.

Разбира се, като източник на РНК трябва да вземем клетки, в които желаният ген се експресира. Например ако ще изследваме дрождените белтъци на топлинния шок, трябва първо да нагреем дрождите, за да задействаме съответните гени. Ако ще получаваме рекомбинантен човешки инсулин, трябва да започнем с човешки панкреас, а не например с мозък или плацента. При геномното клониране няма такива ограничения, защото ДНК е една и съща независимо дали се експресира или не.

След като получим и пречистим РНК, трябва от нея отново да получим ДНК. Ретровирусите постигат това при възпроизводството си в клетката. Техният геном кодира ензима обратна транскриптаза, катализиращ матричната синтеза на ДНК върху РНК (вж. раздел Сайт-специфична рекомбинация). Обратните транскриптази на някои птичи и миши ретровируси са търговски достъпни за нуждите на генното инженерство. Към получената РНК добавяме такъв ензим и получаваме нейно ДНК-копие. То се нарича комплементарна ДНК (кДНК от англ. cDNA – copy DNA). Първо се синтезира една верига кДНК, после РНК-матрицата се хидролизира и на нейно място се изгражда втора кДНК-верига. По начин, който няма да обсъждаме, краищата на кДНК се оформят така, все едно ги е рязала рестриктаза.

1.3. Плазмидни вектори за експресия

Сега вече имаме молекули ДНК, които можем да включим във вектор. Понякога векторът отново е фаг, но по-често се предпочитат плазмидни вектори. Навикът на фагите да помитат всичко след себе си става досаден, ако искаме рекомбинантният белтък да се трупа. За разлика от фагите плазмидите се възпроизвеждат в бактерията, без да я убиват.

Проникването на плазмид или друга чужда ДНК в бактерия се нарича бактериална трансформация. Явлението е известно много преди ерата на генното инженерство. Чрез опити с мишки Ф. Грифит през 1928 установява, че пневмококи от безвреден щам стават вирулентни, ако се смесят с убити пневмококи от вирулентен щам. От това наблюдение произлиза името трансформация (лат. transformatio – превръщане). По-късно (през 1944) О. Ейвъри, К. Маклеод и М. Маккарти обработват безвредния щам с пречистени съставки от болестотворния щам, за да разберат коя от тях предава вирулентността. Трансформация настъпва при добавяне на ДНК, но не и на белтъци, липиди, полизахариди или РНК. Това е един от историческите опити, разкрили ДНК като носител на наследствеността. Впрочем безвредните пневмококи не са по-добронамерени от другите, а просто имунната система ги унищожава по-успешно, понеже нямат капсула. Те стават вирулентни, когато се снабдят с ген, отговорен за образуването на капсула.

Днес трансформацията не се провежда толкова "на тъмно". За да осъзнаем доколко сме се отдалечили от ранните опити, уместно е да разгледаме един конкретен плазмиден вектор, наречен pBluescript. Той се основава на природния плазмид colE1, но върху изходната молекула са сложени толкова "кръпки", че тя вече трудно се разпознава. Подробна информация за него е дадена на адрес http://www.stratagene.com/products/displayProduct.aspx?pid=267. На долната схема най.важните последователности са удебелени.

Последователността pUC ori е начало на репликация, взето от друг плазмид – pUC.

Вляво се вижда ген за устойчивост към ампицилин. Всички плазмидни вектори съдържат ген, придаващ устойчивост към някакъв антибиотик. Наричаме го селекционен маркер, защото позволява на бактериите, които включват вектора, да оцелеят в среда със съответния антибиотик, докато бактериите без плазмид загиват. Тук трябва отново да се подчертае, че използваната в генното инженерство E. coli не може да се развива в човешкия организъм.

lacZ (вдясно) е ген за ензима бета-галактозидаза. Произлиза от бактериалната хромозома на E. coli и е един от структурните гени на лактозния оперон (вж. раздел Регулация на транскрипцията при прокариоти).

Малко след началото на гена е вмъкнат полилинкер. Той съдържа плътно подредени места за 21 рестриктази. В хода на работата с една от тях се прави разрез и се вмъква кДНК. Генът lacZ се разкъсва и вече не може да даде продукт. Фенотипно това се проявява в загуба на бета-галактозидазната активност. Затова пък с помощта на промотора на лактозния оперон, служил досега на lacZ, инсертът може да се презаписва.

1.4. Получаване на кДНК-библиотека

Нека да предположим, че искаме да клонираме и експресираме даден ген с помощта на вектора Bluescript. Получаваме кДНК от тъкан, в която генът е активен. Обработваме вектора с рестриктазата, към която сме нагласили кДНК. Смесваме вектора с кДНК и добавяме ДНК-лигаза реакция. Молекулите кДНК ще се превърнат в инсерти, разположени насред бета-галактозидазния ген lacZ. Ето схема на събитията дотук:

Идва ред на самата трансформация: векторът се добавя към клетки на E. coli. Щамовете, подлагани на трансформация с плазмидни вектори, трябва да отговарят като цяло на същите условия като при използване на фагови вектори.

Макар че се създават възможно най-подходящи условия за трансформация, плазмидите не могат да се мерят с фагите по "проникваща способност". По отношение на влизането в клетката фагите са професионалисти, докато плазмидите са аматьори. Все пак, когато даден ген изобщо се експресира, клетката съдържа много негови мРНК. Затова можем да се надяваме поне няколко кДНК за нашия ген да стигнат до цитоплазмата на бактериалната клетка-гостоприемник.

Изчаква се трансформацията да протече и бактериите се прехвърлят в петрита за култивиране. В хранителната среда трябва да има добавен ампицилин. Бактериите, които са включили вектора, са станали устойчиви към ампицилин и ще се развиват добре. Нетрансформираните клетки ще загинат и няма да ни се пречкат повече. Скринирането би било непосилно, ако включваше и тях.

Бактериите се нанасят върху средата във вид на рядка суспензия, така че клетките да са далеч една от друга (както фагите по-рано). Всяка трансформирана бактерия дава отделна колония, която е кръгла като при фагите. Но докато фаговите колонии са разширяващи се дупки, бактериалните колонии са плътни, изпъкнали, "съзидателни" образувания.

Плодът на досегашните ни усилия, т.е. множеството бактериални колонии в петритата, представлява библиотека. За да се отличава от геномната, тя се нарича генна или кДНК-библиотека. В нея са събрани гените, работили в последните 1-2 часа от живота на изходната клетка.

1.5. Експресия на клонирания ген и първично скриниране на кДНК-библиотеката

Ако имаме сонда за гена, който ни интересува, можем да скринираме библиотеката чрез Садърн-блот. Така ще отберем клоновете, в които инсерт е кДНК за нашия ген. След това трябва да предизвикаме експресия на инсертите и да видим кои от тях наистина могат да дадат желания белтък. Предизвикването на експресия и "виждането" на белтъка не са проблем; ще ги разгледаме след малко.

Не винаги обаче можем да постъпим така. Случва се да се интересуваме от белтък, чийто ген не е изучен. Някой е успял да пречисти белтъка и да го изследва, но за гена му не се знае нищо... освен че съществува, доколкото всеки белтък е продукт на ген.

За да намерим гена в кДНК-библиотеката, трябва да я скринираме по принципно различен начин. Като начало трябва да получим антитяло срещу въпросния белтък. То, а не някаква нуклеотидна последователност, ще ни служи като сонда.

Следващата стъпка е да накараме бактериите от кДНК-библиотеката да експресират вкараната в тях кДНК. Това не е трудно, доколкото промоторът на всеки вектор за експресия е много добре изучен и се знае от какво се активира. В случая имаме работа с лактозния промотор и за да го индуцираме, трябва да добавим в средата лактоза. (На практика се използва неин несмилаем синтетичен аналог, който върши дори по-добра работа). Промоторът се освобождава от своя репресор и транскрипцията започва. В плазмидите, които не съдържат инсерт, ще се транскрибира lacZ. След транслация на получената мРНК ще се получи бета-галактозидаза и нищо повече.

Ако обаче във вектора е включена кДНК, РНК-полимеразата, след като отмине промотора и началната част на разкъсания lacZ, ще започне да презаписва тази кДНК. Ако инсертът няма собствен терминатор (поне не и такъв, който да работи в E. coli), транскрипцията ще продължи до терминатора на lacZ.

Така ще се получи РНК-транскрипт. Той ще се свърже с рибозомите на бактериалната клетка, тъй като носи Шайн-Далгарновата последователност на lacZ. Рибозомата ще започне белтъчна синтеза от началния кодон пак на lacZ, но много бързо ще се придвижи до преписа от кДНК.

Сега нещата донякъде опират до случайността и късмета. В някои клонове нужната кДНК ще присъства наопаки (обърната със задния си край към промотора). В други клонове тя ще е включена с главата напред, но така, че да е в неподходяща рамка на четене. Транслацията няма да стигне доникъде и в двата случая (по-точно казано, в 5 от всеки 6 случая). Има обаче вероятност 1/6 вмъкнатата кДНК да съвпадне с lacZ по рамка на четене. Тогава транслацията ще продължи, докато стигне до стоп-кодона на клонирания ген. Ще се получи т. нар. слят белтък, в който първите няколко аминокиселини са от бета-галактозидазата, а останалите – от желания белтък, кодиран от клонираната кДНК.

Бактериите, които експресират слетия белтък, се наричат трансгенни. С този термин се означава и всяка друга клетка или организъм, в която с методите на генното инженерство е клониран и се експресира чужд ген.

Дава се време на белтъка да се понатрупа. След това колониите се отпечатват върху нитроцелулозна хартия. Върху нея освен ДНК се задържат и белтъците.

Сега е време да прибегнем към антитялото срещу нашия белтък. Хартията се залива с разтвор на това антитяло. Измежду многото белтъци то ще намери своя антиген и ще се свърже с него. Следователно, ако някоя бактериална колония произвежда желания белтък, то нейният отпечатък върху хартията ще се покрие с антитяло. На антитялото се дава време да реагира с антигена, остатъкът се излива и хартията се промива.

Вижда се, че действията приличат на тези при имуноцитохимията. И тук обикновено нашето антитяло се използва небелязано, а после с него се свързва белязано второ антитяло. Белегът тук най-често е ензим за цветна реакция.

И така, след проявяването по хартията ще се появят петна върху някои отпечатъци. Това са отпечатъците от колониите, в които кДНК от нужния ген присъства и се експресира. Сега трябва да се намерят съответните колонии върху петрито-"оригинал".

Ето схема на описаните дотук действия (промиванията не са означени):

1.6. Вторично скриниране чрез имуноблот

Полученият набор от "перспективни" колонии се подлага на второ скриниране. От всяка набелязана колония се извлича белтък в отделна епруветка. Тези проби се подлагат на SDS-електрофореза в полиакриламиден гел. Белтъците се разделят по молекулни маси на отделни ивици, една от които ще съответства на рекомбинантния белтък.

След електрофорезата гелът се долепя до лист нитроцелулозна хартия и белтъците се пренасят върху нея. За разлика от случая с нуклеиновите киселини капилярният пренос не върши работа. Затова белтъците се изтласкват върху хартията от електрично поле – електропренос.

След това хартията се обработва както при първото скриниране: първо антитяло, второ антитяло и визуализиране на белега. Тук не можем да не си спомним за блотовете при изследването на нуклеиновите киселини. Методът, включващ белтъчна електрофореза, електропренос, реакция на първото антитяло с антигена върху хартията, реакция на белязаното второ антитяло с първото антитяло и проявяване на белега, също се причислява към блотовете. Нарича се Western (англ. западен) или имуноблот. В българската литература се предпочита второто име. Всъщност гореописаното скриниране на кДНК-библиотека с антитяло представляваше точков имуноблот.

Имуноблотът се прилага много широко и извън генното инженерство – всъщност всеки път, когато някъде се търси някакъв белтък. Освен това в имунологията целта на имуноблота се обръща наопаки: белтъците върху хартията горе-долу се знаят, а като първо антитяло се слага серум с неизвестна специфичност. Когато се установи с кои ивици реагира, прави се извод какви антитела съдържа.

След имуноблота се набелязват колониите, произвели най-добрите ивици, и инсертите им се секвенират. От получената последователност на кДНК може да се изведе последователността на белтъка, ако ни трябва. Между другото има методи и за пряко секвениране на белтъци. Може да се попита защо в този случай трябва да се мъчим да клонираме гена, вместо направо да секвенираме изходния пречистен белтък. Отговорът е, че макар разчитането на първичната структура на белтъците да е разработено още преди съответния метод за ДНК, то е много по-трудно и по-скъпо. Затова всеки предпочита да клонира кДНК и да разчете нейната първична структура, дори ако не възнамерява да използва клона за друго.

1.7. Биологична активност на рекомбинантните белтъци

Ако рекомбинантният белтък е получен със замисъл да се използва в медицината или стопанството, той се подлага на още редица изследвания. Трябва да се провери например дали физичните и биохимичните му свойства съвпадат с тези на "първообраза", пречистен от изходния организъм. Най-важен обаче е тестът, който сравнява изходния и рекомбинантния белтък по биологична активност. Ако сме искали да получим хормон, инжектираме рекомбинантния белтък в опитно животно; ако става дума за ензим, смесваме го със субстрата му.

Понякога се оказва, че нужната кДНК е клонирана и се експресира, но белтъкът не е като истинския – различава се по някои свойства и няма биологична активност. Най-честата причина за това са особености в нагъването и посттранслационни модификации. Те са обичайни за еукариотните белтъци, но са много по-слабо застъпени в прокариотната клетка. Затова произведените от E. coli чужди белтъци ще се трупат във вида, в който слизат от рибозомата. Лишени от посттранслационната обработка, много белтъци не страдат забележимо, но някои губят активността си.

Един пример за рекомбинантен белтък (може би най-известният) е човешкият инсулин. Генът му кодира доста дълъг полипептид, наречен препроинсулин. Успоредно със синтезата си той се прехвърля в ендоплазмената мрежа, сигналният му пептид се отрязва и така препроинсулинът се превръща в проинсулин. Той се нагъва и образува дисулфидни връзки, които крепят пространствената му структура. След това средната му част, наречена С-пептид, се изрязва; тя е била нужна само за правилното му нагъване. Остават два пептида, наречени А- и В-верига и включващи общо 51 аминокиселини. Те съставят зрелия, функционално годен инсулин.

Да се клонира инсулинова кДНК в прокариотен вектор за експресия е сравнително просто, но да се научи бактерията да извършва гореописаната посттранслационна обработка е практически невъзможно. Затова в бактерията е клонирана последователността на проинсулина и от нея се извлича проинсулин, а не инсулин. За следващите етапи има грижата човекът. Проинсулинът се поставя при подходящи условия, така че да заеме нативна конформация и да образува правилните дисулфидни мостове. След това се обработва с протеази, които изрязват С-пептида. Така се получава биологично активен и неимуногенен "човешки" инсулин, който остава само да се пречисти.

В много случаи обаче функционален рекомбинантен белтък по-лесно може да се получи чрез клониране в клетка, която знае какво да го прави, т.е. в еукариотна клетка.

2. Клониране и експресия на гени в еукариоти

2.1. Генно инженерство при дрожди

Ако търсим подходящ еукариотен гостоприемник за клониране и експресия на кДНК, често най-подходящи са хлебните дрожди Saccharomyces cerevisiae. Те растат и се размножават бързо почти като чревните бактерии. Отглеждането им е евтино и не буди опасения от практическо или морално естество. Поради твърде далечното си родство с бозайниците дрождите не могат да съдържат вируси или приони, опасни за човека, така че произведените от дрожди рекомбинантни белтъци са чисти от такива патогени. Същевременно дрождите разпознават и обработват правилно много от сигналните последователности на човешките белтъци и така им осигуряват структурата, нужна за биологичната им активност. (А ако не разпознават дадена сигнална последователност, тя винаги може при клонирането да се замени с подходяща дрождена последователност.)

Векторът за прокариотна експресия, в който понастоящем се намира нашият ген, вече не може да ни бъде полезен. Трябва да извадим кДНК оттам и да я включим във вектор, годен да осигури експресия в дрожди. Същевременно е добре да не се отказваме напълно от бактериалния гостоприемник – в него е най-удобно да размножим вектора, преди да трансформираме с него дрождите. Ето защо са създадени т. нар. вектори-совалки, способни да "живеят" както в E. coli, така и S. cerevisiae. Те се основават на плазмид на E. coli (любимият е pBR322) и имат основните принадлежности на плазмиден вектор – начало на репликация, ген за устойчивост към антибиотик и полилинкер. Това позволява да развъждаме вектора в чревни бактерии неограничено дълго и да го получаваме в голямо количество – както преди включването на нашата кДНК в него, така и след това.

Освен това векторите-совалки носят допълнителни последователности, нужни за клонирането и експресията в дрожди. На първо място трябва да се осигури присъствието и репликацията на вектора в клетката-гостоприемник. Някои вектори имат последователност, която осигурява вграждането им в някоя хромозома чрез хомоложна рекомбинация. Други вектори са свободни плазмиди – имат начало на репликация, чрез което се възпроизвеждат автономно като при бактериите, само че не в цитоплазмата, а в ядрото. (Дрождите за разлика от многоклетъчните еукариоти търпят плазмиди.) Трети тип вектори освен начало на репликация носят и центромерна последователност и се държат като мини-хромозоми. Някои вектори от този тип съдържат и теломерни последователности и с право се наричат изкуствени хромозоми.

Освен това е нужен селекционен маркер, който да осигури предимство на трансформираните дрождени клетки. Това може да бъде пак ген за устойчивост към антибиотик или друго съединение, токсично за нетрансформираните дрожди. Също така може да се вземе ауксотрофен щам дрожди (т.е. мутанти, лишени от определен важен ензим) и вектор, съдържащ ген за същия ензим.

Най-накрая, всеки вектор-совалка съдържа дрожден промотор, терминатор и подходящо разположен между тях полилинкер. Така чуждата кДНК се вмъква във вектора и след това се експресира под контрола на дрождения промотор.

За да се трансформират дрождените клетки, т.е. векторът да се вкара в тях, стената им се разрушава химично или се уврежда чрез електрически импулси (електропорация). По-нататъшните действия не се различават принципно от това, което вече описахме за бактериите.

Пример за важен рекомбинантен белтък, получаван от дрожди, е HBsAg – повърхностният антиген на вируса на хепатит В. След като се пречисти, той служи като ваксина. Генът му е клониран в плазмид. Експресира се посредством промотор от дрожден ген за гликолитичен ензим. От дрожден ген за друг ензим (аспартат-карбамил-трансфераза) пък е взет терминаторът.

2.2. Трансгенни (генетично модифицирани) растения

Макар че трансгенните растения се очаква да станат важни производители на рекомбинантни фармацевтични продукти в близкото бъдеще, засега генното инженерство при зелените растения не е от кой знае какъв интерес за бъдещия медик. Тук обаче ще му посветим кратък откъс най-вече заради многото митове на тази тема, родени от невежество и конкуретна пропаганда и наводнили обществените представи и законодателството. Примери за такива митове са, че трансгенните растения и получените от тях храни могат да заразят човека с патогени и да разстроят хормоналното му равновесие, да не говорим, че имат вкус на дърво и пластмаса. (Ако трябва да коментираме – крайно невероятно е трансгенно растение да бъде опасно за консумация, освен ако не е било поначало замислено като биологично оръжие; колкото до вкуса – тъй като на съвременните селскостопански борси се търсят красиви и трайни плодове и зеленчуци без оглед на вкуса им, сортове с вкус на дърво са създадени с методите на класическата селекция и са превзели западните пазари много преди ерата на генното инженерство.)

Предимствата на трансгенните растения пред класическите сортове могат да бъдат различни: подобрени хранителни качества (например обогатяване на ориза с каротин – предшественика на витамин А); устойчивост към насекоми-вредители; устойчивост към вируси; устойчивост към хербициди; поносимост към солена почва. Да видим втория пример, т.е. как се постига устойчивост към насекоми-вредители. Бацилът Bacillus thuringiensis е патоген за ларвите на редица насекоми. Той притежава ген за инсектициден белтък – токсин, който при попадане в храносмилателната система на ларвата лизира чревните й епителни клетки и така я убива. Белтъкът е безвреден за останалите животни; B. thuringiensis се използва за биологична защита на растенията от много години без забележима вреда върху екосистемите. Ако накараме селскостопански растения да експресират съответния ген, ларвите-вредители ще платят с живота си всеки опит да се хранят с техните тъкани.

За растителното генно инженерство много полезно се е оказало изучаването на фитопатогена Agrobactеrium. Той предизвиква образуване на растителни тумори, за да живее в тях и да се храни с тъканта им. Туморите всъщност се причиняват от един плазмид на бактерията, наречен Ti (съкр. от англ. tumor-inducing). След като растението бъде заразено, Ti-плазмидът се прехвърля от бактериалната в растителна клетка, интегрира се в нейна хромозома и причинява злокачествената й трансформация. За щастие той не е канцерогенен за животните и човека. На основата на природния Ti-плазмид са създадени вектори за клониране и експресия на чужди гени в растителни клетки. Чрез тях можем да вкараме в клетки от желаното културно растение инсектицидния ген на B. thuringiensis и да го експресираме.

Разбира се, при многоклетъчните еукариоти получаването на трансгенна клетъчна култура не е всичко; обикновено ни трябва цял трансгенен организъм. При растенията обаче тази стъпка не е много трудна, защото няма дълбока пропаст между соматични клетки и клетки на половия път. Много клетки, произлезли от соматични тъкани, при промяна в условията дават начало на нов пълноценен организъм – соматична ембриогенеза. Трансгенното растение по-нататък ще се размножава нормално, освен ако умишлено не е създадено да бъде стерилно (за да се успокоят страховете на гражданството или за да се принудят земеделците да купуват семена за всяка сеитба).

2.3. Клониране и експресия на чужди гени в клетки от бозайници

Векторите, използвани за клониране и експресия на кДНК в клетки от бозайници, най-общо приличат на използваните при дрождите вектори-совалки. И тук имаме плазмидно начало на репликация и други последователности, нужни за развъждането на вектора в бактерии.

Полилинкерът се разполага между промотор и терминатор, които осигуряват транскрипция на инсерта в бозайникови клетки. За да бъде презаписването по-ефективно, добре е да се предвиди и енхансер. Често се предпочитат не клетъчни, а вирусни промотори и енхансери, които са силни и работят в широк набор от тъкани.

Освен това, разбира се, векторът трябва да дава предимство на клетките, които са го приели. Селекционният маркер и тук е ген за устойчивост към съединение, токсично за нормалните клетки. Често се използва генът neo, изолиран от бактерии, устойчиви към антибиотика неомицин. Самият неомицин действа върху прокариотите, но неговият аналог G418 е токсичен за еукариотните клетки. Двете съединения са антибиотици от групата на аминогликозидите, а neo кодира ензима аминогликозид-фосфотрансфераза. Когато се експресира в еукариотна клетка, neo я прави устойчива към G418.

Остава да се помисли за присъствието на вектора в ядрото на клетката-гостоприемник. Напредналите еукариоти не съдържат в ядрата си плазмиди или други малки молекули ДНК. И да бъдат вкарани, те бързо биха се загубили. Само молекула с размерите и сложността на хромозомите може да се държи правилно при митозата. Ако просто искаме да видим как ще изглежда рекомбинантният белтък в еукариотна клетка, можем да се примирим с нетрайността на малките ДНК. Вкарваме вектора в клетката и я наблюдаваме усърдно през следващите часове – т. нар. преходна експресия.

Често обаче се нуждаем от трайна експресия. Тогава е нужно векторът да се включи в някоя хромозома. За целта най-често се използват ретровирусните последователности LTR, съкр. от англ. long terminal repeats – дълги крайни повтори. Те заграждат от двете страни генома на ретровирусите и отговарят за интеграцията на провируса чрез сайт-специфична рекомбинация. Включени на подходящи места във вектора, LTR му помагат да се вмъкне в генома на гостоприемника.

И така, включваме избраната кДНК във вектора с помощта на рестриктаза и ДНК-лигаза (точно както при вектора за прокариотна експресия). Сега рекомбинантната молекула трябва да се въведе в еукариотни клетки. Ако ДНК просто се остави при клетките, някои от тях ще я погълнат сами. Процесът обаче става по-ефективен, ако с електричен разряд се създадат временни дупки в клетъчната мембрана (електропорация) или ДНК се вкара в клетката ръчно чрез микроинжектиране.

Веднъж влязла вътре, част от чуждата ДНК се интегрира на случайни места в хромозомите. Това проникване на ДНК в клетката напомня бактериалната трансформация. При еукариотите обаче (особено при многоклетъчните животни) се предпочита терминът трансфекция, защото трансформация е бил наречен друг процес – когато еукариотната клетка придобива способност да се дели неограничено и да предизвиква рак. Впрочем между двете има връзка: трансформация може да се постигне чрез трансфекция с ДНК от онкогенни вируси (при животните) или с Ti-плазмид (при растенията).

След като оставим клетките да общуват известно време с вектора, поставяме ги в среда с G418, за да се отървем от всички, които не са трансфектирани. Клетките, които остават, би трябвало да са включили рекомбинантната молекула. Остава да направим скриниране, за да видим къде генът работи.

Животинските клетки се отглеждат доста по-трудно от бактериалните и дрождените. Средата освен хранителни вещества трябва да съдържа и телешки фетален серум, защото без някои негови белтъци (растежни фактори) клетките не искат да се делят. Средата е течна; следователно, ако искаме да разделим потомството на различните клетки, трябва да осигурим за всяка от тях отделен съд. Дъното е широко – за повечето клетки е важно да лежат върху твърда опора. Съдът не се пълни много, за да не се затрудни дишането. Средата се сменя периодично, а когато клетките покрият дъното, се разпределят в нови съдове. По този начин можем да поддържаме културата неограничено дълго... стига тя да е способна да се дели неограничено дълго. Клетките, изолирани от нормален организъм – т. нар. първични клетъчни култури, имат потенциал за краен брой деления (няколко десетки), след което остаряват и отмират. Съществуват обаче и т. нар. устойчиви или безсмъртни клетъчни линии – клонове клетки, които произвеждат ензима теломераза и съответно не стареят (вж. раздел Механизъм на репликацията). Ако искаме трансгенните клетки да се делят неограничено, трябва да вземем такава линия.

2.4. Получаване на трансгенни животни

Създаването на клетъчна линия, която експресира интересуващия ни ген, е достойно и много често достатъчно постижение. Понякога обаче е важно да се установи как експресията на даден ген би се отразила на организма като цяло. Така стигаме до задачата да получим трансгенни животни, чиито клетки съдържат и експресират чуждата ДНК.

Трансгенни екземпляри са получени от редица видове, но любимото животно за такива изследвания е мишката. Първите трансгенни мишки са получени чрез инжектиране на вектора в един от пронуклеусите на зиготата. Днес обаче е възприет друг, много по-лесен и евтин подход.

При злокачествено израждане на първични полови клетки се получава тумор, наречен тератокарцинома. Той включва недиференцирани клетки, наречени зародишни стволови клетки, и късчета от най-различни "тъкани", получени при тяхното диференциране. При подходящо подбрани условия в култура зародишните стволови клетки могат да се отглеждат като обикновена безсмъртна линия. За разлика от повечето ракови клетки обаче зародишните стволови клетки са запазили способността си за диференциране. Ако се поставят при други обстоятелства, като се инжектират в ранен зародиш, те започват да се превръщат във всички възможни клетъчни типове.

Генът, който искаме да експресираме в мишка, първо се клонира в зародишни стволови клетки. След това ги инжектираме в ранни миши зародиши (на етап бластоциста), както е показано на снимката.

Микроинжектиране на зародишни стволови клетки в бластоциста на възраст 3,5 дни. От Bradley (2004) с любезното му разрешение.

Попаднали в бластоцистата, стволовите клетки се включват в ембриогенезата наравно с клетките-домакини. Получава се мишка, в която мирно съжителстват клетки от изходния зародиш и потомци на зародишната стволова линия. Такъв организъм, съставен от клетки с различен произход, се нарича химера (името е взето от гръцката митология, където означава чудовище с тяло на козел, лъвска глава и змийска опашка). Ако зародишните стволови клетки и бластоцистата произлизат от различно оцветени миши линии, химерите могат да се разпознаят по петнистата окраска. 

Химерна мишка. Тъмните петна произлизат от зародишните стволови клетки. От Bradley (2004) с любезното му разрешение.

Самата химера няма да даде много сведения, защото не се знае колко от клетките й носят гена и в кои органи са попаднали. Надеждата е, че някои от зародишните стволови клетки са се включили в родословието на гаметите. Ако това е станало, гаметите ще предадат на потомството нашия ген наравно с другите гени. Затова химерите се оставят да се размножават и всяко от малките се проверява (чрез Садърн-блот или PCR) дали е трансгенно.

Един от най-ефектните примери за трансгенен бозайник е т. нар. "зелена мишка". Тя е получена, като в миши зародиши е вкаран генът за т. нар. зелен флуоресцентен белтък от медузата Aequorea victoria. Понеже е снабден с актинов промотор и цитомегаловирусен енхансер, генът се експресира в почти всички тъкани. Както се вижда на долната снимка, новородените трансгенни мишлета при подходяща светлина флуоресцират в зелено. Когато попораснат, добиват по-обикновен вид, защото козината не флуоресцира. Независимо от възрастта си зелените мишки са идеални за опити с присаждане и съвместно култивиране на клетки, защото техните клетки, където и да попаднат, могат да бъдат разпознати.

Три новородени зелени мишлета и (в средата) тяхно братче или сестриче, което не е включило гена за флуоресцентния белтък. От http://133.1.15.131/tg/tg-ad.cfm с любезното разрешение на M. Okabe.

За жалост подходящи зародишни стволови клетъчни линии засега са получени само при мишки. Ако искаме да получим друг трансгенен бозайник, трябва или да използваме добрия стар метод с инжектиране в зиготата, или да създадем първична клетъчна култура, да клонираме гена в нейни клетки и след това да клонираме самите клетки. (Клонирането на соматични бозайникови клетки ще бъде разгледано по-нататък.) Така можем да получим например крави, в чието мляко основните белтъци са заменени с човешки, за да не се дразни имунната система на кърмачетата.

Не винаги добавената ДНК е изцяло чужда на организма. Често се вкарва ген, който животното и без това притежава, с цел да се увеличи количеството на генния продукт – свръхекспресия. Свръхекспресията се постига чрез внасяне на многобройни копия от гена или/и чрез подмяна на промотора му с по-силен. В раздел Регулация на транскрипцията при еукариотите беше споменат такъв пример: дрозофилите с допълнителни очи, които са трансгенни животни със свръхекспресия на гена eyeless.

2.5. Унищожаване (нокаут) на гени

Предизвикването на свръхекспресия може да покаже много за функцията на гена. Още повече обаче може да се научи от клетки и организми, в които генът не работи. Още пионерите на генетиката са били заинтригувани от нулевите мутации. Отначало са били улавяни редките спонтанни мутации, а после, за да станат по-чести, животното е било обработвано с мутагени. И в двата случая обаче мутациите засягат случайни места и са нужни много усилия, за да се разкрие кой е повреденият ген.

Днес, ако даден ген е клониран, можем с рутинни методи да получим лишена от него клетъчна линия и дори цял организъм. Процедурата се нарича унищожаване на гена или нокаут (от англ. knock-out – изваждане със сила). Да разгледаме как става това при мишки. Първо във вектор се клонира началната част на гена, най-често първият му екзон. След това в нея чрез рестриктази и лигаза се вмъква последователност, съдържаща гена neo. С рекомбинантната молекула се трансфектират зародишни стволови клетки. В някои от тях ще настъпи хомоложна рекомбинация, при която нашият инсерт ще измести началото на гена от хромозомата. Това е нов момент: досега се интересувахме само от това какви последователности въвеждаме, а сега – и от мястото, където те се интегрират.

От атакувания ген всъщност не е загубено нищо, но той е разкъсан от neo и престава да функционира. Всеки опит генът да се презапише ще завърши още насред разкъсания първи екзон, при терминатора на neo, така че единственият продукт на експресията му ще бъде кодираният от neo ензим.

След трансфекцията клетките се поставят в среда с G418. Оцелелите се скринират, за да се провери дали инсертът е където трябва (някои клетки случайно могат да включат neo на друго място чрез нехомоложна рекомбинация и така да се спасят). След това от добрите клетки се получават химерни животни и трансгенно потомство, както беше описано по-горе.

Първите трансгенни животни са хетерозиготи, защото е малко вероятно в рекомбинация да участват и двете хомоложни хромозоми на зародишната стволова клетка. Обикновено хетерозиготите успяват да използват добре единственото си копие от гена и са видимо здрави. От тях се получават нокаут-животни – хомозиготи по рекомбиниралата хромозома, изцяло лишени от продукта на изследвания ген. Остава техният фенотип да се изучи внимателно и да се опише.

По-долу е дадена схема на нокаутиране, която илюстрира и получаването на всякакви (не само нокаут) трансгенни мишки. Нормалният алел е нарисуван като черна отсечка, а инсертът neo – като бяла "дупка". Присъствието на функционален алел в хромозомата се означава с (+), а липсата му – с (–).

Ето един добър пример за изследване на генна функция чрез получаване на нокаути. Белтъкът CBFA1 е транскрипционен регулатор. Хората, хетерозиготни по мутации на неговия ген, страдат от болестта клейдокраниална дисплазия. Тя се изразява в деформации на скелета: липсваща ключица, мека фонтанела на черепа и допълнителни зъби (общо до 60). Мутациите не са наблюдавани в хомозиготно състояние. От това може да се предположи, че са летални и че CBFA1 е много важен, но без генното инженерство стигаме дотук. Унищожаването на гена при мишки показва, че CBFA1 е главен контролен ген за развитието на костна тъкан. Без неговия продукт мезенхимните клетки не могат да се диференцират до остеобласти и скелетът е напълно лишен от кости. Мишлетата-нокаути (–/–) умират няколко минути след раждането, напразно опитвайки се да поемат дъх с хрущялния си гръден кош. Мишките, хетерозиготни по изключения ген (+/–), фенотипно приличат на болните хора.

Скелетен фенотип на новородени мишлета с различен генотип по CBFA1: див тип (+/+), хетерозигота (+/–) и нокаут (–/–); оцветяване с алцианово синьо за хрущял и ализариново червено за кост. Вижда се, че скелетът на нокаута е изцяло хрущялен. От Mundlos (2005) с любезното му разрешение.

Понякога изключването на ген води до изненадващи резултати. Пример за това е FosB – ген за транскрипционен регулатор, който се експресира в нервната система и участва в реакциите й спрямо дразнения. Мишките с изключен FosB са видимо здрави, но не могат да отгледат малки – мишлетата им умират 1-2 дни след раждането. Първата мисъл на изследователите е, че женските нокаути имат физиологичен дефект в износването или кърменето на малките. Но се оказва, че проблемът е изцяло в поведението. Майката-нокаут не се грижи за новородените си и затова те скоро умират от глад и студ. Заедно с белтъка FosB си е отишъл и майчиният инстинкт.

3. Сравнение на някои основни биологични методи

След като разгледахме накратко възможностите на генното инженерство, добре е да сравним основните методи за специфично откриване на биополимери, които бяха споменати разхвърляно в хода на изложението. Разбира се, те се използват много широко и извън генното инженерство. За по-нагледно ги даваме в таблица.